外周血单个核细胞（PBMC）制备方法及注意事项
2021-03-01发表外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC），是指外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞（Lymphocyte）、单核细胞（Monocyte）、树突状细胞（DC）和其他少量细胞。PBMC可利用健康人或动物供体的外周血，通过Ficoll密度梯度离心，磁珠分选等步骤获得，主要包括淋巴细胞和单核细胞。
Ficoll是蔗糖的多聚体，中性，平均分子量400,000，当密度为1.2g/mL，未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
人PBMC中不同细胞类型的比例
PBMC中大部分都是淋巴细胞，包括B细胞和T细胞，其中CD3+ T细胞又占了淋巴细胞中绝大部分(45-70%)。这些T细胞都处于初始（naive）状态，即已经成熟了但没有受到抗原刺激。 在正常人中，只有非常小的一部分初始T细胞会因抗原识别而被激活。同样的B细胞也都处于初始状态。相对于淋巴细胞，单核细胞的比例在10-30%，收到刺激之后会发育成树突状细胞(DC)或巨噬细胞。干细胞的比例非常低，只有0.1-0.2%，因此很难从全血样本中分离到。
1.设备与试剂
全血 （以10ml为例）
无菌PBS溶液(pH7.4) 或者生理盐水
蔗糖溶液（Ficoll Pague PLUS) (GE Healthcare Life Sciences #17-1440-02)
RPMI 1640培养基 （Invitrogen）
胎牛血清（FBS）（GIBCO）
双抗P/S （Penicillin/ Streptomycin) (GIBCO)
二甲亚砜（DMSO）（SIGMA）
预先装好异丙醇的冻存盒
2.方法/步骤
配制所需的溶液：
a. 细胞培养基：RPMI 1640+10% FBS+1% P/S；
b. 细胞冻存液：FBS中加入10%DMSO；
（2）取两支15ml离心管，先加入5ml Ficoll溶液。然后将稀释的血液轻轻加到两支离心管的ficoll上层，一定要轻柔，避免两种溶液混合在一起，每只离心管各10ml稀释血液；
（3）2,000rpm，20min，注意，降速设置中一定要设置成no break，或者只有1-2成的制动。离心完毕将得到如图所示分层；
（4）PBMC所在细胞层为白色。此时可以用吸管将该层细胞吸取在另一干净的15ml离心管中。
（5）加入PBS至10-15ml，1,500rpm，10min离心后去掉上清，再加入培养基进行相同操作的清洗；
（6）加入5-10ml培养基重悬细胞，进行后续计数培养或者铺板；
（7）细胞冻存：将细胞离心收集之后，用细胞冻存液重悬。取1-1.5ml细胞至冻存管中，放入冻存盒（冻存盒可事先在4℃冰箱预冷）。再将冻存盒放置于-80℃冰箱过夜。第二天将细胞转入液氮中长期保存。
（1）在离心管中加入淋巴细胞分离液Ficoll
（2）取抗凝外周血（全血）与无菌PBS按照1:1充分混匀，用移液管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，动作一定要轻，注意保持清楚的界面。外周血，PBS，淋巴细胞分离液最终体积比为1:1:1。
（3）水平离心400g成×30分钟
（4）离心后可看见管内分为三层，上层为血浆和PBS，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液。在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，主要就是单个核细胞，包括淋巴细胞与单核细胞。此外，还含有血小板。
（5）去除部分上层液体，余下约1mL，用移液器插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一离心管中，加入5倍以上体积的PBS，离心300g×10分钟，洗涤细胞两次。
（6）末次离心后，弃上清，加入红细胞裂解液，室温孵育2分钟，裂解红细胞，可根据情况适当增减时间。
（7）加入10mLPBS，离心300g×10分钟，洗涤细胞两次。
（8）末次离心后，弃上清，加入含有10%FBS的RPMI1640，重悬细胞，计数，计算细胞活力。
注意事项
全血溶液可以加在Ficoll上层或者下层，但是最终都必须保证两种溶液分层清晰。
分离PBMC第一步离心的时候，一定不能设置低水平的制动。否则将分层混乱。
细胞运输与保存
（1）干冰运输，收到细胞后立即转入液氮冻存或直接复苏；
（2）T25瓶运输细胞，收到后应继续生长，传代达到细胞生长状态良好时，再进行冻存，具体操作步骤见细胞培养步骤。
PBMC收到后注意事项：
（1）收到PBMC细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时反馈。
（2）先不打开瓶盖，瓶身擦拭酒精后放培养箱静置四小时，稳定细胞状态，切忌在温箱内静置过夜。
（3）静置后镜检，拍照，记录细胞状态。建议传代后也拍照记录细胞生长情况。
（4）贴壁细胞：若细胞密度超过80%，可正常传代；若未超过80%，收集细胞瓶内的培养基，留8ml继续培养至80%左右再传代，瓶盖可稍微拧松。
（5）细胞瓶内的培养基含血清和双抗，可收集后4℃保存备用，可补加2%血清。刚开始传代时建议一半用细胞瓶内的培养基，一半用自备的培养基，使细胞逐渐适应培养条件，以免因不适应而造成生长状态不佳。
（6）细胞胰酶消化液建议使用PBS配制。
不同种属PBMC：人，猴，犬，大鼠，小鼠
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货号 |
产品 |
状态 |
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0621011/0621012 |
人外周血单个核细胞PBMC |
Fresh/Frozen |
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0621021/0621022 |
猴外周血单个核细胞PBMC |
Fresh/Frozen |
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0621031/0621032 |
比格犬外周血单个核细胞PBMC |
Fresh/Frozen |
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0621041/0621042 |
大鼠外周血单个核细胞PBMC |
Fresh/Frozen |
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0621051/0621052 |
小鼠外周血单个核细胞PBMC |
Fresh/Frozen |
外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC），是指外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞（Lymphocyte）、单核细胞（Monocyte）、树突状细胞（DC）和其他少量细胞。PBMC可利用健康人或动物供体的外周血，通过Ficoll密度梯度离心，磁珠分选等步骤获得，主要包括淋巴细胞和单核细胞。
Ficoll是蔗糖的多聚体，中性，平均分子量400,000，当密度为1.2g/mL，未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
人PBMC中不同细胞类型的比例
PBMC中大部分都是淋巴细胞，包括B细胞和T细胞，其中CD3+ T细胞又占了淋巴细胞中绝大部分(45-70%)。这些T细胞都处于初始（naive）状态，即已经成熟了但没有受到抗原刺激。 在正常人中，只有非常小的一部分初始T细胞会因抗原识别而被激活。同样的B细胞也都处于初始状态。相对于淋巴细胞，单核细胞的比例在10-30%，收到刺激之后会发育成树突状细胞(DC)或巨噬细胞。干细胞的比例非常低，只有0.1-0.2%，因此很难从全血样本中分离到。
1.设备与试剂
全血 （以10ml为例）
无菌PBS溶液(pH7.4) 或者生理盐水
蔗糖溶液（Ficoll Pague PLUS) (GE Healthcare Life Sciences #17-1440-02)
RPMI 1640培养基 （Invitrogen）
胎牛血清（FBS）（GIBCO）
双抗P/S （Penicillin/ Streptomycin) (GIBCO)
二甲亚砜（DMSO）（SIGMA）
预先装好异丙醇的冻存盒
2.方法/步骤
配制所需的溶液：
a. 细胞培养基：RPMI 1640+10% FBS+1% P/S；
b. 细胞冻存液：FBS中加入10%DMSO；
（2）取两支15ml离心管，先加入5ml Ficoll溶液。然后将稀释的血液轻轻加到两支离心管的ficoll上层，一定要轻柔，避免两种溶液混合在一起，每只离心管各10ml稀释血液；
（3）2,000rpm，20min，注意，降速设置中一定要设置成no break，或者只有1-2成的制动。离心完毕将得到如图所示分层；
（4）PBMC所在细胞层为白色。此时可以用吸管将该层细胞吸取在另一干净的15ml离心管中。
（5）加入PBS至10-15ml，1,500rpm，10min离心后去掉上清，再加入培养基进行相同操作的清洗；
（6）加入5-10ml培养基重悬细胞，进行后续计数培养或者铺板；
（7）细胞冻存：将细胞离心收集之后，用细胞冻存液重悬。取1-1.5ml细胞至冻存管中，放入冻存盒（冻存盒可事先在4℃冰箱预冷）。再将冻存盒放置于-80℃冰箱过夜。第二天将细胞转入液氮中长期保存。
（1）在离心管中加入淋巴细胞分离液Ficoll
（2）取抗凝外周血（全血）与无菌PBS按照1:1充分混匀，用移液管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，动作一定要轻，注意保持清楚的界面。外周血，PBS，淋巴细胞分离液最终体积比为1:1:1。
（3）水平离心400g成×30分钟
（4）离心后可看见管内分为三层，上层为血浆和PBS，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液。在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，主要就是单个核细胞，包括淋巴细胞与单核细胞。此外，还含有血小板。
（5）去除部分上层液体，余下约1mL，用移液器插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一离心管中，加入5倍以上体积的PBS，离心300g×10分钟，洗涤细胞两次。
（6）末次离心后，弃上清，加入红细胞裂解液，室温孵育2分钟，裂解红细胞，可根据情况适当增减时间。
（7）加入10mLPBS，离心300g×10分钟，洗涤细胞两次。
（8）末次离心后，弃上清，加入含有10%FBS的RPMI1640，重悬细胞，计数，计算细胞活力。
注意事项
全血溶液可以加在Ficoll上层或者下层，但是最终都必须保证两种溶液分层清晰。
分离PBMC第一步离心的时候，一定不能设置低水平的制动。否则将分层混乱。
细胞运输与保存
（1）干冰运输，收到细胞后立即转入液氮冻存或直接复苏；
（2）T25瓶运输细胞，收到后应继续生长，传代达到细胞生长状态良好时，再进行冻存，具体操作步骤见细胞培养步骤。
PBMC收到后注意事项：
（1）收到PBMC细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时反馈。
（2）先不打开瓶盖，瓶身擦拭酒精后放培养箱静置四小时，稳定细胞状态，切忌在温箱内静置过夜。
（3）静置后镜检，拍照，记录细胞状态。建议传代后也拍照记录细胞生长情况。
（4）贴壁细胞：若细胞密度超过80%，可正常传代；若未超过80%，收集细胞瓶内的培养基，留8ml继续培养至80%左右再传代，瓶盖可稍微拧松。
（5）细胞瓶内的培养基含血清和双抗，可收集后4℃保存备用，可补加2%血清。刚开始传代时建议一半用细胞瓶内的培养基，一半用自备的培养基，使细胞逐渐适应培养条件，以免因不适应而造成生长状态不佳。
（6）细胞胰酶消化液建议使用PBS配制。
不同种属PBMC：人，猴，犬，大鼠，小鼠
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货号 |
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人外周血单个核细胞PBMC |
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猴外周血单个核细胞PBMC |
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0621031/0621032 |
比格犬外周血单个核细胞PBMC |
Fresh/Frozen |
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0621041/0621042 |
大鼠外周血单个核细胞PBMC |
Fresh/Frozen |
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0621051/0621052 |
小鼠外周血单个核细胞PBMC |
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